看得更深、更清、更快，是生命科學(xué)研究的永恒追求。從神經(jīng)元的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)到線粒體的瞬息動(dòng)態(tài)，每一個(gè)生命過程都在三維空間中上演。然而，傳統(tǒng)成像技術(shù)往往需要在成像深度、速度、分辨率之間做出取舍。西安交通大學(xué)雷銘教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的高信噪比光學(xué)切片結(jié)構(gòu)光顯微系統(tǒng)，如同為顯微鏡裝上“智能降噪器”，讓結(jié)構(gòu)光顯微鏡既能穿透毫米級厚組織，又能捕捉細(xì)胞器級的精細(xì)動(dòng)態(tài)。

圖1 高信噪比光學(xué)切片結(jié)構(gòu)光顯微系統(tǒng)。

想象一下，你想觀察一個(gè)完整的器官，比如老鼠的大腦，看里面的神經(jīng)元是如何連接成網(wǎng)的。傳統(tǒng)的顯微鏡往往只能看薄薄的切片，想看厚一點(diǎn)的樣本，光線就會(huì)被散射和吸收，圖像變得模糊不清，就像隔著毛玻璃看東西。為了看清活體組織內(nèi)部的3D結(jié)構(gòu)，科學(xué)家們開發(fā)了各種顯微技術(shù)。比如，共聚焦顯微鏡，它像用一個(gè)小針眼擋住雜散光，圖像對比度高，但掃描速度慢，光照強(qiáng)，容易把活細(xì)胞“照死”。光片顯微鏡光照溫和、速度快，但對樣本的大小和透明度要求苛刻。光場顯微鏡能一次拍下整個(gè)3D圖像，速度極快，但犧牲了圖像的精細(xì)度。在眾多技術(shù)中，有一種叫光學(xué)切片結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Optical Sectioning Structured Illumination Microscopy, OS-SIM）的方法具有綜合性優(yōu)勢。它的原理很巧妙：不是用“針眼”擋光，而是向樣本投射一組有明暗條紋的光，像給樣本“打上碼”。由于只有焦平面上的條紋是清晰的，離焦背景是模糊的，通過計(jì)算，就能把屬于焦平面的清晰信息解調(diào)出來，實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片。這就像從一張疊影重重的照片里，只提取出你想要的那一層。OS-SIM的優(yōu)點(diǎn)很明顯：速度快、光毒性低，非常適合觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)。但它有一個(gè)致命傷：看不了厚組織。當(dāng)光線穿透到組織深處，比如幾百微米甚至幾毫米厚的大腦，熒光信號會(huì)急劇衰減，同時(shí)背景噪聲（雜散光）會(huì)大大增強(qiáng)。這導(dǎo)致投射的條紋對比度變差，就像在濃霧里打光，看不清條紋了。此時(shí)，傳統(tǒng)的解碼算法就會(huì)失效，輸出的圖像信噪比極低，結(jié)構(gòu)淹沒在噪聲里。因此，OS-SIM一度被認(rèn)為只適合看20微米以下的薄樣本。

這就是當(dāng)前領(lǐng)域面臨的核心科學(xué)問題：如何在保持OS-SIM高速、低毒優(yōu)勢的同時(shí)，突破厚組織帶來的信噪比瓶頸，實(shí)現(xiàn)更深、更清晰的3D成像？針對這個(gè)難題，最近西安交通大學(xué)物理學(xué)院雷銘團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套全新的策略——“HT-SHiLo”（圖2A）。它不像傳統(tǒng)方法那樣“硬啃”那些已經(jīng)變模糊的條紋信息，而是采取了一套組合拳：

(1).取長補(bǔ)短：它從兩張帶條紋的圖像中提取可靠的、包含結(jié)構(gòu)輪廓的低頻信息；同時(shí)，從常規(guī)的寬場圖像中提取精細(xì)的邊緣細(xì)節(jié)（高頻信息）。把這兩者巧妙地融合，就得到了一幅既清晰又干凈的光切片圖像。

(2).空域重構(gòu)：整個(gè)過程在空間域進(jìn)行，避免了耗時(shí)的傅里葉變換，處理速度極快，單層圖像僅需5.4毫秒，為實(shí)時(shí)3D成像鋪平了道路。

效果如何？令人驚喜的是，這項(xiàng)技術(shù)能將圖像的信噪比提升約10分貝，成像深度直接翻倍（圖2B-D）。用它觀察經(jīng)過透明化處理的老鼠大腦，穿透深度能達(dá)到驚人的2.4毫米。無論是小鼠腦中密密麻麻的神經(jīng)元（圖3）、果蠅大腦里調(diào)控晝夜節(jié)律的時(shí)鐘神經(jīng)元，還是人類結(jié)腸類器官的精細(xì)結(jié)構(gòu)，都展現(xiàn)出了前所未有的清晰度。更重要的是，它依然保持著OS-SIM“溫柔”的本色。使用極低的光照，他們成功記錄下了活細(xì)胞中線粒體長達(dá)5分鐘的3D動(dòng)態(tài)變化（包括融合與分裂），以及遷移體——一種在細(xì)胞遷移過程中產(chǎn)生的新細(xì)胞器——長達(dá)80分鐘的生長和脫落全過程（圖4）。

HT-SHiLo算法讓OS-SIM從一個(gè)“淺層觀察者”升級為能深入組織內(nèi)部的“探索者”，同時(shí)保持了高速、低光毒性的核心優(yōu)勢。該技術(shù)已在小鼠腦組織、果蠅神經(jīng)、人類類器官、活細(xì)胞線粒體和遷移體等多種生物樣本中得到驗(yàn)證，展現(xiàn)出廣泛的適用性。使用該技術(shù)，生物學(xué)研究者可以用更快的速度、更低的成本、更保護(hù)樣本的方式，去探索那些以往難以觸及的領(lǐng)域——比如完整器官內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接、腫瘤組織深處的微環(huán)境、以及發(fā)育過程中細(xì)胞群的協(xié)同行為。這項(xiàng)技術(shù)提供的不只是一張更清晰的圖片，更是一個(gè)連接微觀動(dòng)態(tài)與宏觀結(jié)構(gòu)的橋梁，期待能夠與更多領(lǐng)域的科學(xué)家合作，共同開啟生物3D成像的新篇章。

上述研究成果以“Structured illumination microscopy for high SNR 3D imaging from millimeter-thick tissues to cellular dynamics”為題發(fā)表在《The Innovation》。該論文以西安交通大學(xué)物理學(xué)院為第一單位，合作單位包括北京腦科學(xué)與類腦研究所，西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所、華夏成像科技有限公司等多家單位。論文第一作者為西安交通大學(xué)物理學(xué)院王孟瑞博士，通訊作者為西安交通大學(xué)物理學(xué)院雷銘教授。這項(xiàng)工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。雷銘團(tuán)隊(duì)長期從事先進(jìn)光學(xué)顯微成像技術(shù)及其在生物學(xué)中的應(yīng)用研究，所研制的結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微鏡具有國際領(lǐng)先水平，與國內(nèi)外多家科研機(jī)構(gòu)開展了研究合作。團(tuán)隊(duì)獲批“先進(jìn)光學(xué)成像融合人工智能”陜西省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)。更多內(nèi)容可參見雷銘教授團(tuán)隊(duì)校內(nèi)主頁http://gr.xjtu.edu.cn/web/ming.lei

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666675826000688?via%3Dihub

圖2 基于HT-SHiLo的OS-SIM實(shí)現(xiàn)高信噪比3D成像。(A) HT-SHiLo算法流程圖。HT，希爾伯特變換；OS，光學(xué)切片圖像；WF，寬場圖像；GLPF，高斯低通濾波器；GHPF，高斯高通濾波器；Lo，低頻；Hi，高頻。(B) HT、HiLo和HT-SHiLo算法重建的透明化小鼠腦切片神經(jīng)的3D圖像對比。(C) 各算法在不同成像深度下的信噪比。(D) 不同成像深度下各算法所得光學(xué)切片與WF圖像的對比。

圖3 組織透明化的小鼠腦切片中神經(jīng)與神經(jīng)元的三維圖像。(A) 全腦切片的最大強(qiáng)度投影（MIP）圖像。(B) 檢測到的神經(jīng)元三維分布圖。(C) 神經(jīng)元密度分布圖（單位：個(gè)/mm3）。(D-F) 圖A中對應(yīng)區(qū)域的高度偽彩MIP圖像。(G-I) 圖D-F中放大區(qū)域的HT算法與HT-SHiLo算法成像效果對比。

圖4 遷移中的Tspan4-GFP標(biāo)記的NRK細(xì)胞及其遷移體的動(dòng)態(tài)延時(shí)成像。(A) 初始時(shí)刻遷移細(xì)胞的高度偽彩MIP圖像。(B) 圖A中紅框區(qū)域的細(xì)胞遷移過程，可見細(xì)胞尾部留下收縮纖維。(C) 圖A中黃框內(nèi)遷移體的生長過程。分別展示了沿橙色線的xoy平面和xoz平面截面圖，并測量了沿橙色線和藍(lán)色線的熒光強(qiáng)度變化。(D) 圖A中綠框內(nèi)遷移體的斷裂過程。